Багато захворювань вимагають створення нових, більш чутливих методів для свого визначення. Багато з тих, що вже є, допомагають у постановці діагнозу, проте не завжди роблять це достовірно. Точно діагностувати більшість інфекційних захворювань в даний час може гніздова ПЛР. Що ж це за дослідження?
Загальні відомості про полімеразної ланцюгової реакції

Вперше ПЛР стала використовуватися в молекулярній біології. Суть даної реакції полягає в наступному - збільшенні кількості ДНК-фрагментів в досліджуваному розчині за допомогою реакції ампліфікації. Крім того, дана реакція дозволяє проводити штучні мутації в певних фрагментах спадкового матеріалу, клонування генів, дослідження генетичної інформації.
Метод полягає в копіюванні певних фрагментів ДНК в спеціально створених для цього умовах. Копіюється лише певний фрагмент, так як його вибірковість задається дослідником шляхом створення тих або інших умов середовища і додавання певних компонентів реакції (ферментів, промоторів та термінаторів).

Реакція дозволяє ампліфікувати невеликі ділянки ДНК (на відміну від реакції реплікації, що протікає в живих організмах). В результаті виникає середу з дочірніми фрагментами ДНК, утвореними на оригінальній матриці, отриманої з біологічного матеріалу.

Аналіз крові: що входить в обстеження?
Обов'язковий склад компонентів даної реакції наступний:
1. Матриця або ділянку, копії якого необхідно отримати. Зазвичай в якості матриці виступає геном вірусної або бактеріальної клітини (так як ПЛР зазвичай проводиться з метою діагностики інфекційних захворювань).
2. Праймер - ділянка нуклеотидной ланцюга з вільною гідроксильної групою, за допомогою якого починається нарощування ланцюжка ДНК з 3-комплиментарного кінця досліджуваної ДНК.
3. ДНК-полімераза. Основний фермент полімеразної ланцюгової реакції. З його допомогою відбувається нарощування нуклеотидів в новоствореній ланцюга ДНК.
4. дезоксирибонуклеозидтрифосфатов.

5. Магній. При наявності даних іонів в розчині можлива активність ДНК-полімерази.
6. Буферна середовище, в якому протікають всі реакції.
7. Висококиплячі масла. Використовуються з метою запобігання випаровування реакційного середовища.
8. пірофосфатази. Застосовується для збільшення освіти клонів досліджуваної ДНК (за рахунок інгібування освіти пірофосфату, який, у свою чергу, інгібує утворення клонів).
В основному проводиться ПЛР з використанням двох пар праймерів - «гніздова».

Обстеження на інфекції, що передаються статевим шляхом
В даний час ПЛР отримала широке поширення в дослідженні інфекцій, що передаються статевим шляхом (ІПСШ). Найбільш частою варіацією ПЛР є ПЛР-6 - реакція, спрямована на виявлення в досліджуваному матеріалі хламідій, уреаплазм, мікоплазм і трихомонад. Реакція спрямована на виділення їх ДНК-компонентів (так як у виділеннях зі статевих шляхів не міститься їх антигенів або продуктів метаболізму, адже дані паразити - внутрішньоклітинні). Інші методи не використовуються, оскільки за їх допомогою можливе визначення продуктів життєдіяльності або самого мікроорганізму у виділеннях зі статевих шляхів. Певної інформативністю ще володіє мікроскопія мазка зі специфічною забарвленням або електронна мікроскопія. Незважаючи на це, для діагностики ІПСШ все ж воліють використовувати ПЛР.

Як і будь-яка інша полімеразна реакція, ПЛР-6 на виявлення ІПСШ протікає в 3 етапи:
1. На першій стадії проводиться нагрівання досліджуваної суміші до приблизно 90 градусів (при даній температурі відбувається денатурація ланцюга ДНК з розривом межцепочечних зв'язків). Нагрівання проводиться протягом 2-3 хвилин. З утворенням одноланцюгових фрагментів перша стадія закінчується і починається наступна.
2. На наступній стадії проводиться поступове охолодження реакційної суміші для того, щоб праймери могли з'єднатися з нитками ДНК. Стадія носить назву відпалу. При неправильно підібраного температурі (золотим стандартом є температура приблизно на 5 градусів нижче температури плавлення праймерів) можливе спотворення результатів реакції та отримання не тих ділянок ДНК, що планувалося (якщо температура нижче необхідної), або неспецифічних компонентів реакції (при завищенні температури). Стадія триває приблизно 30 секунд, за цей час ДНК-полімераза вже утворює кілька сотень пар нуклеотидів клону ДНК.

3. На третій стадії, стадії елонгації, відбувається подовження синтезованої ланцюга ДНК. Вона проводиться в два етапи: на першому етапі, який йде впродовж 10 хвилин, відбувається подовження основного ланцюга клона, а на другому етапі, стадії фінальної елонгації, добудовуються можливо присутні в розчині непарні одноцепочечниє компоненти.
Як видно, час кожного з етапів достовірно відомо, однак воно розраховане для ідеальних умов. Зазвичай же реакція може протікати і менше або більше заданого часу - це залежить від концентрації речовин, наявності матриці.

унікальність обстеження
Особливістю гніздовий ПЛР є те, що на першому етапі утворюється спеціальна частина молекули ДНК - кДНК, яка служить матрицею для наступного етапу. Однак через можливе перехресного взаємодії часті випадки отримання хибнопозитивних або хибнонегативних результатів.
У результаті всіх проведених етапів дослідник отримує розчин з містяться в ньому побудованими на оригінальній матриці фрагментами ДНК. Кількість їх обумовлено часом всіх етапів, кількістю реагентів, умовами середовища.

Зазвичай в розчині переважають специфічні продукти - фрагменти ДНК, обумовлені впровадженням праймерів. Інші речовини і молекули, утворені в ході реакції, специфічними не є, оскільки для їх утворення праймери не потрібні. Незважаючи на це, іноді вони можуть мати вирішальне значення в постановці того чи іншого діагнозу.
Діагностика ІПСШ, обумовлених внутрішньоклітинними паразитами, проводиться на підставі наявності клініки, скарг пацієнта. Для дослідження беруть мазок слизової оболонки статевих органів (у виділеннях не завжди можна виявити, наприклад, хламідій). Винятком є ситуація, коли достовірно відомо, що у виділеннях зі статевих органів присутні клітини слизової оболонки.

Пізніше отримані мазки вносяться в середу, після чого і починається реакція ПЛР. Її хід нічим не відрізняється від стандартної: ті ж етапи, ті ж вимагаються речовини.
При визначенні інфекцій, що передаються статевим шляхом, використання крові для дослідження зазвичай недоцільно, оскільки в дуже рідкісних випадках збудник проникає у внутрішнє середовище організму (в такому випадку можливий розвиток інших захворювань, що протікають атипово (наприклад мікоплазменна або хламідійна пневмонія, уреоплазменної менінгіт).

результати діагностики
Діагноз того чи іншого захворювання виставляється на підставі визначення специфічної ДНК, характерної для того чи іншого мікроорганізму (у справжньому випадку генетичного матеріалу даних внутрішньоклітинних збудників). Якщо результат негативний, не варто відразу ставити негативний діагноз, так як реакція могла піти не так, як належить, в результаті чого почали утворюватися не ті фрагменти ланцюгів ДНК. Хибно позитивні результати можливі в тому випадку, коли відбулося перехресне реагування (тобто ланцюг ДНК нормальної клітини могла мутувати з імітацією наявності мікроорганізму). Проте зазвичай при дотриманні всіх умов реакція протікає правильно, а її чутливість та специфічність практично рівні 100%.

Безперечними перевагами даної реакції є точність отриманих даних, висока чутливість та специфічність, а також швидкість отримання результатів (зазвичай дослідження займає не більше одного дня).
Недоліками реакції є складність дотримання всіх вищезгаданих умов, точність створення температурного і кислотного режиму. Крім того, для проведення даної реакції необхідна наявність складного обладнання, придбати яке здатна не кожна лабораторія. Для ідентифікації отриманих результатів потрібно висококваліфікований людина, обізнане про хід реакції, її можливих продуктах і здатний правильно інтерпретувати отриману інформацію з метою постановки правильного діагнозу.

Зазвичай ПЛР на ІПСШ призначають у тому випадку, коли загальноклінічним методом встановити діагноз не вдається. До таких методів відносять загальний аналіз крові і сечі, біохімію крові, а також бактеріологічне дослідження (посів) за наявності секрету зі статевих шляхів.
В цілому, ПЛР дуже хороший метод для діагностики більшості захворювань. Його висока точність і специфічність дозволяють визначити практично будь-яке інфекційне захворювання зі стовідсотковою вірогідністю. З часом дана методика обов'язково увійде в мінімальний перелік аналізів для діагностики більшості захворювань, пов'язаних з інфекційним процесом і генетичними мутаціями.